钱 渊
中国实用儿科杂志 2019 Vol.34（2）：97-99
摘要
呼吸道感染是儿科最常见的疾病之一，临床表现多样，严重者可致死亡。病毒是最常见的致病原之一，尤其对于小婴儿。敏感、特异、快速的病原诊断是正确诊治的重要保证。近年来，新的病毒病原诊断方法不断涌现，该文就各种诊断技术和方法的优缺点和临床实际应用价值做一阐述。
关键词
呼吸道感染；病毒；儿童；病原诊断
作者单位：首都儿科研究所病毒研究室 儿童病毒病病原学北京市重点实验室， 北京 100020
电子信箱：yqianbjc@263.net
急性呼吸道疾病是影响人类健康的常见病、多发病。病毒感染常常是这些疾病的直接病因或激发因素，对于儿童（尤其是婴幼儿）更是如此。儿童呼吸道病毒感染的临床表现多样，从轻微的、自限性的上呼吸道感染到严重的甚至是致死性的下呼吸道感染，季节性明显，往往会在短时间内引起门、 急诊患儿的突然大幅度增加， 随之而来的是住院床位的供不应求，这些都对儿科临床造成巨大的压力。因此，儿科医务工作者准确识别呼吸道病毒感染，制定恰当的诊治策略和应对措施，避免抗生素的过度使用是个非常重要的临床实际问题。
1 儿科呼吸道病毒病原的诊断概况
2000年以前， 儿科最常见的、 经典的呼吸道病毒包括： 呼吸道合胞病毒、 流感病毒（甲型和乙型）、 腺病毒、 副流感病毒（1、 2、 3型）。之所以说是“最常见的”和“经典的”， 是因为这些呼吸道病毒发现于20世纪50年代以后， 与急性呼吸道感染的病原关系的确定经历了病毒分离、 血清学试验（双份血清）和流行病学研究， 因此这些结果和结论翔实可靠、经久不衰。2000年以后，随着分子生物学技术的不断创新、 推广和应用， 人偏肺病毒、 鼻病毒和副流感病毒（4型）与儿科急性呼吸道感染的关系逐渐被大家所认识和重视。还有一些新发的病毒（如博卡病毒）， 虽然病原学关系尚待确认， 但是由于较高的检出率， 也引起了大家的高度关注［1］ 。
由于新的技术和方法不断研发和推出，现代的病毒感染的病原诊断可以根据各医院的具体情况选择不同的技术和方法，并且可以通过融会贯通、联合应用多种技术，使得病毒病原的诊断更加切合患儿的实际（即不同的病程阶段和病情严重程度）［1］。可用的技术包括病毒分离（仅限于常见呼吸道病毒，仍为不容置疑的金标准）、用各种免疫学方法检测病毒抗原（如直接或间接免疫荧光法、酶联免疫法、免疫层析法等）和病毒核酸扩增法（检测病毒的基因-DNA或者RNA）。这三种类型是在感染的相应部位检测病毒；还可以用检测病毒特异性抗体的方法（血清学试验）来做出病毒病原诊断，要根据患儿的不同的病程阶段来考虑选择检测不同的特异性抗体种类。具体的方法在这期《中国实用儿科杂志》有专门的文章介绍，本文不赘述。本文将结合文献、国内儿科临床的具体情况和笔者所在实验室的经验和体会，就当前面对众多的方法和技术，儿科医师和医院的病毒病原检测的相关部门如何选择诊断技术作一个简要论述，以供参考。
1.1 病毒分离 尽管常见呼吸道病毒的分离是公认的、无可置疑的病原诊断金标准，对于绝大部分的儿童医院来说还是无法做到，只有少部分兼做研究的医院可做。用病毒分离的方法，连续性地每年从患儿的临床标本中分离到各种呼吸道病毒的流行毒株，对于诊断病毒学的可持续发展是一项十分重要、不可或缺的工作［2］。
1.2 病毒抗原检测 病毒抗原是指在病毒侵入呼吸道上皮细胞后活跃复制、增殖的过程中产生的病毒蛋白，因为可以在感染过程中刺激肌体产生相应的抗体而称为抗原。病毒只有在侵入靶细胞并且活跃增殖的情况下才能引起呼吸道症状。因此在疾病的早期，抗原检测（不管采用何种方法）是对于病原确定以便正确诊治的好策略！其诊断价值不亚于传统的病毒分离或快速病毒分离（shell vial），并且因为出结果快而使得其实用性优于病毒分离［3］。而诸多的抗原检测方法中，直接或间接免疫荧光法因为需要采集到患儿的呼吸道脱落上皮细胞（呼吸道病毒感染的靶细胞）作为检测的标本，荧光标记的单克隆抗体与在细胞中病毒感染后增殖的特定部位［细胞核和（或）细胞浆］结合，在荧光显微镜下可以直观地看到特征性的定位荧光而判断结果，因此，有很强的特异性。在发病的早期，抗原检测即可显示荧光阳性［4］。该方法在采集到高质量标本（含足够量的呼吸道脱落上皮细胞）前提下，敏感性和特异性可以与病毒分离相当；另外，因操作时间相对较短（2～3 h），符合临床上敏感、特异和快速的要求［3］，因此，在相当长的时期内成为国内外儿科的病毒诊断实验室的首选方法，并且在当前也不失为最好的方法之一，尤其对于住院患儿来说更是推荐选用。目前有商品化的试剂盒，可以用1份标本同时检测7种常见的呼吸道病毒（如果加上偏肺病毒的单克隆抗体，可以检测8种呼吸道病毒，国外的试剂盒是这样组合的）［5］。 免疫层析法（如金标法等“纸条法”）因为出结果快、操作简便（操作人员不需要特殊的技术专长），在临床上也是十分受欢迎，国外的专科医师诊所（成人及儿科）内由医师或护士直接操作，国内还是由临床检验部门来做。目前国内外应用最多的“纸条法”是流感病毒（甲型/乙型），质量好的试剂盒在敏感性和特异性上可与病毒分离相比［6］。国外儿科广泛应用的免疫层析法还有呼吸道合胞病毒、腺病毒［3］，而国内尚处于开始阶段。相比免疫荧光法，“纸条法”取1份标本只能做单一的病毒，对标本的质量（是否采集到足够量的上皮细胞）也无法判断，故对于普遍反映该方法的敏感性低的问题笔者在此难以评价。
1.3 病毒核酸检测 病毒核酸检测是随着20世纪80年代末聚合酶链反应（PCR）技术发明以来快速发展起来的。由于与抗原检测相比，核酸扩增技术的敏感性大大的增加了检出率，而且实时荧光PCR或RT-PCR又可以克服早期PCR技术的实验室污染问题的瓶颈，使得核酸检测在呼吸道病毒病原诊断中快速地得到推广应用。近年来，多重PCR技术使得用同一管反应能够同时检测几乎所有的呼吸道病毒，而且随着反应时间的缩短，仪器的日渐小型化，在一些实验室多重核酸检测的技术逐步取代了抗原检测，尤其是当一些新上市的试剂盒是以“症状为组合”为设计理念的（developed as syndromic panels），加上了如肺炎支原体、肺炎衣原体等呼吸道病毒以外的常见病原，更加受到了临床的青睐。然而尽管有这些突出的优点，核酸检测的短处也日益显露出来。首先，核酸扩增法检测过于灵敏，有极少量的病毒基因也能被检测到，而且由于可检测到病毒核酸的时间窗长，阳性结果不能明确告诉医师是本次感染的病毒病原，还是以前（上次）感染遗留的病毒核酸，该病毒是否还有感染性（传染性）［7］。多重PCR还往往得到两种以上病毒同时阳性的结果，以至于很难判断哪种病毒是本次临床疾病的病原；这种情况在抗原检测中就很少发生，因为抗原检测法得到的是病毒活跃增殖中产生的病毒蛋白，而且在发病早期出现，阳性结果维持时间不长，在急性呼吸道感染中，阳性结果从临床症状出现时起，一般维持7 d左右（最长不超过10 d）并呈逐渐减弱的趋势。所以，抗原检测仍然有着其他方法所缺乏的优势［3］，那就是与病毒活跃增殖的密切相关性所决定的对病原诊断的可靠性。
2 儿科呼吸道病毒病原的诊断所面临的挑战
尽管病毒病原诊断的技术日新月异，也被越来越多的医院临床所接受应用，呼吸道病毒病原的诊断仍然面临着严峻的挑战。
最突出的是理念的挑战！有一种观点非常具有代表性，那就是由于大多数呼吸道病毒缺乏特异的治疗药物，临床医师会认为准确的病毒病原诊断的实际意义不大，根据血常规、C反应蛋白等检测结果判断是病毒感染，对症治疗就是了。这种想法阻碍了病毒病原的诊断。实际上不同的病毒所引起的疾病预后是不一样的，不同的呼吸道病毒可能引起相似的临床表现，而有了准确的病原诊断，一定会促进临床的诊断和治疗。例如，在当前（2018—2019年流感季）流感流行中，如果没有流感病毒的病原诊断，不会使临床医师认识流感合并的脑病，会把脑病当成一般的病毒性脑炎和脑膜炎，而忽略流感本身。还有，即使在流感高峰季节，流感样病例中仍有相当一部分是由流感病毒以外的呼吸道病毒引起的，如果不做病原检测而盲目使用抗流感药物，会使得耐药毒株快速生成。因此，临床医师对病原检测必要性的认识是十分重要的，临床医师的需求直接影响了一个医院的病毒病原诊断的应用、发展和进步。
其次，尽管目前市场上供应的诊断试剂很多，而且还在不断增加，可应用于临床的（即有批准文号的）诊断试剂远远不能满足需求，而且良莠并存，因此，在应用于临床前，应该认真地做好拟采用的试剂盒的质控和评估，最理想的是与公认的标准方法进行比较，以保证检测质量的可靠性，这在发达国家的临床检验科已经是常规了，在国内可能大部分的儿科医院都做不到，所以会对检测结果的可靠性大打折扣。此外，在应用了某一种诊断方法和试剂一段时间后，应该及时总结和回顾所用试剂的敏感性、特异性和可靠性，加强同临床医师的沟通，以不断改进。
最后，也是不能忽视的最重要的一点，采集到合格的标本是取得可信结果的第一步，也是基本保证！临床上要对采集标本的人员（住院医师或护士）进行培训，而检验人员应该对送来的标本进行初步评估，看是否真正采集到了符合要求的标本。因为只有病毒在细胞内快速增殖才能引起相应的疾病，检测到的结果才是真正可信的结果。对于不合格的标本，不能简单地打上“阴性”了事，而要注明标本“不合格”，以便于临床医师对结果做出客观的判断。
3 结语与展望
尽管与发达国家相比，我们的呼吸道病毒病原诊断的广度和深度都存在着很大的差距，但是我们的进步已经在路上。《中国实用儿科杂志》作为在我国儿科同行中颇具影响力的学术期刊，本期重点选题的设计和实施就是有力的说明！相信随着病毒病原诊断技术的不断进步发展和普及应用，儿科同道们对病毒性呼吸道感染的认识和诊治水平会得到长足的进步，这是一项使医患双方都能获益的举措。
参考文献 (略)
